Dopo la perfusione crioprotettiva, un paziente non viene semplicemente immerso nell'azoto liquido.
Il paziente segue un programma di raffreddamento controllato dal computer della durata di diversi giorni. I sensori all'interno del paziente mostrano se le diverse regioni anatomiche si stiano raffreddando in modo uniforme o stiano sviluppando pericolosi gradienti termici.
Il problema ingegneristico cambia durante la discesa. Il raffreddamento iniziale dovrebbe limitare la formazione di ghiaccio. Vicino e al di sotto della transizione vetrosa, la precisione e l'uniformità termica diventano più importanti della velocità.
Perché il raffreddamento controllato è necessario
Gli agenti crioprotettivi riducono la velocità di raffreddamento necessaria per evitare la formazione di ghiaccio. Essi permettono ai tessuti ricchi di acqua di entrare in uno stato altamente viscoso, simile al vetro, invece di cristallizzare in modo esteso.
La temperatura di transizione vetrosa rilevante, indicata come Tg, dipende dalla soluzione, dalla sua concentrazione e dal metodo di misurazione. Essa rappresenta un intervallo, non una singola soglia biologica universale.
Per le soluzioni rilevanti per la criopreservazione umana, questa regione si trova comunemente vicino a -120°C a -135°C.
Al di sopra di questa regione, un raffreddamento troppo lento può consentire la nucleazione e la crescita del ghiaccio. Al di sotto di essa, il materiale si comporta sempre più come un solido fragile.
Se la superficie si raffredda molto più velocemente del centro, le diverse regioni si contraggono in misura diversa. Lo stress termomeccanico risultante può provocare crepe.
Questo crea un percorso vincolato: raffreddare abbastanza rapidamente prima della vetrificazione, quindi controllare i gradienti e la velocità di raffreddamento mentre il paziente diventa simile al vetro.
Si vedala differenza tra congelamento e vetrificazione per il comportamento di fase sottostante.
La prima scatola di raffreddamento di prima generazione
Il primo sistema di raffreddamento di prima generazione di Tomorrow.bio, denominato V1 cooling box, ha stabilito l'architettura di base per il raffreddamento controllato dell'intero corpo.
Il paziente viene posizionato all'interno di una camera isolata dedicata. Un computer controlla l'ambiente criogenico della camera mentre i termocoppie misurano le temperature in più punti.
Il controller segue una curva programmata piuttosto che applicare un raffreddamento massimo in modo continuo. Ogni canale del sensore viene registrato come parte della storia termica del paziente.
Questo è già fondamentalmente diverso dall'immersione diretta. La macchina può rallentare, mantenere o modificare le condizioni della camera in risposta a ciò che sta effettivamente accadendo al paziente.
Il sistema di seconda generazione basato su dewar
Il design di seconda generazione di Tomorrow.bio sposta il raffreddamento controllato in un dewar costruito appositamente.
Il paziente rimane all'interno del dewar mentre un coperchio specializzato integra l'hardware di raffreddamento, i controlli del computer, le valvole, le connessioni dei sensori e i passaggi per termocoppie.
Le termocoppie sono posizionate in diversi punti all'interno del paziente. Sensori aggiuntivi monitorano l'ambiente termico all'interno del dewar.
Il sistema, pertanto, rileva più del valore di riferimento richiesto. Esso osserva la rapidità con cui le diverse aree misurate del paziente rispondono.
Il computer regola il gradiente di temperatura del dewar e la velocità di discesa per mantenere tali letture entro i limiti consentiti dal protocollo.
Un corpo di grandi dimensioni non può essere perfettamente isotermico durante il raffreddamento. L'obiettivo pratico è minimizzare la dispersione e impedire che qualsiasi area misurata si discosti pericolosamente in avanti o indietro.
La geometria del dewar riduce anche la manipolazione tra raffreddamento controllato e stoccaggio criogenico. La stessa forma chiusa può fornire un ambiente stabile e simmetrico intorno al paziente.
La temperatura di riferimento non è la temperatura del paziente
Un controller può raffreddare rapidamente l'ambiente. Non può tuttavia far corrispondere istantaneamente la temperatura al centro di un corpo umano a quella dell'ambiente.
Il calore deve trasferirsi dai tessuti più profondi verso la superficie. La geometria, la composizione corporea, la distribuzione del crioprotettore e la posizione dei sensori influenzano il ritardo osservato.
Questo è il motivo per cui un solo sensore nella camera è insufficiente. Un ambiente nominale -130°C non dimostra che ogni parte misurata del paziente abbia raggiunto -130°C.
Il sistema di controllo deve considerare sia la temperatura assoluta che la differenza tra i canali. Il punto più lento, quello più veloce e la dispersione complessiva forniscono ciascuno informazioni utili.
Anche la calibrazione, il posizionamento e la continuità delle termocoppie sono rilevanti. Letture implausibili o guasti ai sensori devono essere segnalati piuttosto che essere mediati silenziosamente nella curva.
Il programma di temperatura a tre fasi di Tomorrow.bio
Il protocollo attuale prevede tre fasi distinte. I valori sono obiettivi operativi per questa apparecchiatura e per l'approccio crioprotettivo, non costanti universali per ogni sistema di vitrificazione.
1. Discesa rapida verso -130°C
La prima fase sposta il paziente dalla temperatura del ghiaccio secco verso circa -130°C il più rapidamente possibile, nei limiti di sicurezza consentiti dalla dispersione delle temperature misurate.
La velocità è fondamentale in questa fase poiché le aree non sufficientemente protette possono ancora formare ghiaccio prima che il tessuto diventi simile al vetro.
Il computer non si basa esclusivamente sul tempo trascorso. Esso monitora le termocoppie e regola l'ambiente di raffreddamento intorno al paziente.
2. Consentire un rebound controllato verso -120°C
Dopo aver raggiunto approssimativamente -130°C, il raffreddamento attivo viene ridotto e al paziente è consentito riscaldarsi naturalmente fino a circa -120°C.
Questa è una fase di ricottura. Vicino a Tg, il materiale crioprotetto conserva sufficiente mobilità molecolare affinché parte dello stress meccanico accumulato possa rilassarsi.
Il rimbalzo concede anche alle regioni più calde e più fredde il tempo di avvicinarsi tra loro prima che il materiale venga portato in uno stato rigido e vetroso.
La ricottura non inverte i danni biologici preesistenti. Il suo scopo è più limitato: ridurre i gradienti termici e gli stress creati da un’irregolare contrazione.
3. Scenda a -196°C a circa 1°C per ora
Da circa -120°C, la discesa target è di circa 1°C per ora fino a quando il paziente raggiunge la temperatura dell’azoto liquido.
Quell’intervallo finale di 76 gradi richiede circa tre giorni, anche prima di considerare le soste e le regolazioni di controllo.
Mantenere 1°C per ora in un corpo grande e termicamente eterogeneo rappresenta un problema di controllo, non semplicemente un’impostazione di temporizzazione.
Il controller deve regolare continuamente l’ambiente del dewar affinché i termocoppie interne scendano in modo uniforme senza creare gradienti eccessivi.
Quando una regione rimane indietro, forzare l’ambiente a raffreddarsi ulteriormente potrebbe sovraraffreddare un’altra regione. La precisione implica bilanciare l’intero campo dei sensori, non inseguire una singola lettura.
Perché la fase di annealing è scientificamente plausibile
La ricerca sulla vitrificazione su larga scala individua due zone di fallimento concorrenti: un raffreddamento insufficiente al di sopra di Tg e uno stress meccanico eccessivo intorno e al di sotto di Tg.
Un2024 studio di vitrificazione su scala umana di organi ha utilizzato più sonde interne e ha concluso che la ricottura riduce i gradienti prima che il materiale entri nella fase vetrosa.
Lo stesso studio ha rilevato che il raffreddamento lento al di sotto della regione di annealing aiuta a evitare la ricostruzione di grandi gradienti e stress.
ricerchetermo-meccaniche hanno rilevato che l’annealing vicino a Tg modifica sostanzialmente lo stress residuo e ne indebolisce la dipendenza dal tasso di raffreddamento precedente.
Questi studi supportano la strategia di controllo sottostante. Essi non validano in modo indipendente ogni valore esatto nel protocollo per corpo intero di Tomorrow.bio.
I corpi umani interi sono più grandi e più eterogenei delle soluzioni di laboratorio o degli organi. È necessario mantenere registrazioni dirette della temperatura e imaging post-raffreddamento.
Ciò che il computer registra
L'output utile non è un messaggio che dica “raffreddamento completato”. Si tratta dell'intera serie temporale da ogni canale di temperatura.
La registrazione dovrebbe mostrare velocità, mantenimenti, rimbalzi, gradienti tra i sensori, azioni del controller, allarmi e qualsiasi deviazione dalla curva pianificata.
Questi dati diventano parte dellavalutazione della qualità della criopreservazione.
Dopo il raffreddamento, una TC standardizzata a temperatura dell'azoto liquido può rilevare la distribuzione del crioprotettore, il ghiaccio, deformazioni macroscopiche e fratture che i dati di temperatura da soli non possono rivelare.
Perché terminare alla temperatura dell'azoto liquido
A pressione atmosferica normale, l'azoto bolle vicino a 77.34 kelvin, circa -195.8°C, secondo ilNIST Chemistry WebBook.
La conservazione in azoto liquido è passiva. Finché nel contenitore rimane una quantità sufficiente di liquido, il suo equilibrio di ebollizione mantiene un ambiente criogenico stabile senza refrigerazione meccanica.
La discesa controllata termina solo quando il paziente è termicamente pronto per tale stato stabile. La conservazione non viene utilizzata come sostituto del raffreddamento.
La progettazione e i compromessi della fase successiva sono trattati inmoderni dewar criogenici e conservazione a temperatura intermedia.
In breve: Tomorrow.bio utilizza un raffreddamento controllato dal computer e sensori di temperatura interni. Il processo raffredda rapidamente vicino alla formazione del vetro, allevia lo stress termico, per poi scendere lentamente verso -196°C.
Esplori questo strumento pratico
Utilizzi lo strumento interattivo per esaminare la questione in questo articolo.
Caricamento dello strumento interattivo...
Ulteriori letture